免疫学技术及应用

　　一、免疫酶技术的原理
　　20世纪中期，以放射免疫技术为代表的各种标记免疫技术相继问世，主要原理是将某种可微量或超微量测定的物质（如酶、放射性核素、荧光素、化学发光剂等）标记于抗原（抗体）上制成标记物，加入到抗原（抗体）的反应体系中与相应的抗体（抗原）反应，通过检测标记物的有无及含量而间接反映被检测物的存在与多少。这种将标记技术与抗原抗体反应结合起来的免疫学检测技术以其敏感性高、准确性好、操作简便、易于商品化和自动化等特点逐渐广泛应用于抗原、抗体、补体、免疫细胞、细胞因子等免疫相关物质的检测，也用于酶、微量元素、激素、微量蛋白等体液中各种微量物质的检查。其中，免疫酶技术作为经典的三大标记技术（荧光抗体技术、放射免疫分析和免疫酶技术）之一，在免疫学、医学及其他相关学科的研究中得到最为广泛的应用并不断得以发展。
　　免疫酶技术是把抗原一抗体的特异性免疫学结合反应与酶的高效催化作用原理有机结合起来的一种方法，即把具有高效催化活性的酶类分子通过化学的方法和抗体（或抗原）结合起来成为酶标记物，而所结合的酶分子并不影响其标记的抗原（或抗体）的免疫反应性，使得酶标记物同时具有免疫反应性和化学反应性，将其与待测的抗原（或抗体）结合后，通过酶的活性降解相应底物呈现出肉眼可见的颜色反应，从而显示出该免疫学反应的存在，达到检测抗原（或抗体）的目的。酶的活性、被降解的底物的多少与最终显色反应的程度呈一定的比例关系，显色越深，说明酶降解底物的量越大，与酶标抗体（或抗原）相结合的对应的待测抗原（或抗体）量也就越多。此技术广泛用于已知或未知抗原、抗体的定性和（或）定量检测，也可用于组织中抗原或抗体的定位研究，即酶免疫组织化学技术（参见第二十七章）。

《免疫学技术及应用》首先介绍了天然免疫和获得性免疫中免疫细胞（包括单核巨噬细胞、DC、NK、T细胞、B细胞等）、免疫分子（包括抗体、补体、细胞因子、HLA、TLR等）的理论背景和研究方法。然后介绍了免疫学相关实验技术，如免疫标记技术、流式细胞检测和分选技术、免疫相关分子生物学技术、蛋白质电泳技术、凋亡检测技术等的原理和应用，并融合了免疫学新前沿技术，如RNA干扰技术、miRNA技术、蛋白质相互作用、BIAcore技术、激光扫描共聚焦显微镜技术、动物疾病模型、转基因动物等。《免疫学技术及应用》理论性、实用性和前沿性紧密结合，在阐述免疫学基本技术、经典实验的同时，史注重免疫学技术的新发展与在实际科研工作中的合理应用。《免疫学技术及应用》贯穿理论联系实际的原则，力求原理清晰、简明规范、通俗易懂、要点突出、指导性强，强调实验的影响因素和关键的注意事项，以减少读者存实验方法选择上的失误和操作上的差错。《免疫学技术及应用》编者大多是有着丰富的免疫学教学经验，且在一线从事免疫学科研工作的中青年教师。

目录
前言
第一章 单核吞噬细胞 1
第一节 单核吞噬细胞简介 1
第二节 单核巨噬细胞的分离 2
一、人外周血单个核细胞的分离 3
二、小鼠腹腔巨噬细胞的分离和纯化 4
三、小鼠肺内巨噬细胞的分离 6
四、骨髓巨噬细胞的分离和诱导培养 7
第三节 单核巨噬细胞表型检测 8
一、直接法流式检测巨噬细胞的表型 9
二、间接法流式检测巨噬细胞的表型 10
第四节 巨噬细胞的活化及相关检测 11
一、巨噬细胞的活化 11
二、超氧阴离子的检测 12
三、一氧化氮的检测 13
第五节 巨噬细胞吞噬和杀伤功能的检测 15
一、巨噬细胞吞噬鸡红细胞 15
二、巨噬细胞吞噬FITC标记的细菌 16
三、巨噬细胞杀伤功能的检测 17
四、Fc受体介导的吞噬作用 19
五、FcR介导的黏附作用 20
第六节 巨噬细胞抗肿瘤活性的检测 21
一、H33342释放法检测巨噬细胞对靶细胞的杀伤 22
二、51Cr释放法检测巨噬细胞对靶细胞的杀伤 23
第七节 单核巨噬细胞趋化功能的检测 24
第八节 结语 26
参考文献 28
第二章 树突状细胞 29
第一节 树突状细胞的分离 29
一、小鼠脾脏树突状细胞的分离 29
二、人外周血树突状细胞的分离 31
第二节 树突状细胞的培养 34
一、小鼠骨髓前体细胞培养树突状细胞 34
二、人树突状细胞的培养 35
第三节 树突状细胞表型和功能检测 38
一、表型检测 38
二、吞噬功能检测 39
三、NO检测 40
四、细胞因子的检测 41
五、抗原提呈功能检测 41
六、混合淋巴细胞反应 42
第四节 浆细胞样树突状细胞 43
一、浆细胞样树突状细胞的分离 44
二、浆细胞样树突状细胞的培养 45
三、浆细胞样树突状细胞表型及功能检测 47
第五节 其他树突状细胞亚群 47
参考文献 49
第三章 NK与NKT细胞 50
第一节 概述 50
第二节 NK细胞的分离 51
一、各种NK细胞分离方法的比较 51
二、人的NK细胞的分离 52
三、小鼠的NK细胞的分离 56
第三节 NK细胞的功能检测 60
一、靶细胞的选择 62
二、形态学检测法 62
三、同位素释放实验:51Cr释放检测法 63
四、LDH释放检测法 64
五、AnnexinV/7GAAD标记流式检测法 66
第四节 小鼠体内删除NK细胞 67
第五节 NKT细胞 69
一、人NKT细胞的分离与培养 69
二、小鼠NKT细胞的分离与培养 75
参考文献 77
第四章 T淋巴细胞 78
第一节 引言 78
第二节 T细胞分离 79
一、尼龙棉柱分离法 79
二、E花环分离法 80
三、微量细胞毒法 82
四、磁珠分选法 83
五、流式分选法 84
第三节 T细胞亚群的分离与培养 85
一、CD4＋T细胞及其亚群的分离培养 85
二、CD8＋T细胞分离培养以及CTL的体外诱导 88
第四节 T细胞克隆及T细胞杂交瘤的建立 89
一、人T细胞克隆的建立 89
二、T细胞杂交瘤技术 92
第五节 T细胞增殖实验 95
一、体外增殖检测 95
二、体内增殖检测 99
第六节 抗原特异性T淋巴细胞反应 102
一、CD4＋T淋巴细胞反应 102
二、CD8＋T淋巴细胞反应 103
第七节 混合淋巴细胞反应 105
一、单向混合淋巴细胞反应 105
二、双向混合淋巴细胞反应 106
第八节 CTL杀伤实验 107
一、51Cr释放法 107
二、LDH释放法 109
三、流式细胞标记法 110
四、体内杀伤实验 111
第九节 调节性T细胞的分离、诱导分化与功能检测 112
一、Treg的分离纯化 113
二、Treg的体外诱导分化 114
三、Treg的功能检测 115
第十节 记忆性T细胞的研究方法 117
一、流式胞内染色技术 118
二、Tetramer技术的原理与应用 120
三、TCR转基因小鼠 122
参考文献 124
第五章 B淋巴细胞 126
第一节 概述 126
第二节 B淋巴细胞的分离和亚群鉴定 126
一、B淋巴细胞的分离 126
二、各类B细胞亚群的鉴定和分离 131
三、抗原特异性记忆性B细胞的鉴定 133
第三节 B淋巴细胞的分化发育鉴定 136
一、从造血干细胞到B淋巴细胞的分化鉴定 137
二、B淋巴细胞在骨髓和脾脏中分化发育的检测 139
三、B淋巴细胞在外周免疫系统中的成熟过程检测 144
四、B淋巴细胞的迁移检测 145
第四节 B细胞的功能分析 146
一、B淋巴细胞的活化方法 146
二、B淋巴细胞的增殖检测 147
三、免疫球蛋白的类别转换的诱导和鉴定 150
四、生发中心反应和浆细胞的检测 152
五、B淋巴细胞的信号转导 158
六、从B淋巴细胞中分离脂筏 164
参考文献 168
第六章 抗原制备的原理及应用 169
第一节 天然抗原的制备原理及应用 169
一、抗原的粗提 170
二、抗原的分离纯化 171
三、抗原的浓缩 180
四、抗原的保存 181
五、抗原的鉴定 182
第二节 人工抗原的制备原理 182
一、人工结合抗原 182
二、人工合成多肽抗原的制备原理和应用 184
参考文献 187
第七章 抗体 188
第一节 概述 188
第二节 多克隆抗体的制备及鉴定 189
一、抗血清的制备 189
二、抗血清质量的检测 191
第三节 单克隆抗体的制备及鉴定 191
第四节 基因工程抗体的人源化策略和方法 197
一、基因工程抗体的人源化及其高效表达 198
二、小分子抗体 209
第五节 抗体的纯化 211
一、样品的预处理 211
二、蛋白A或蛋白G交联琼脂糖凝胶亲和层析法纯化抗体 212
参考文献 214
第八章 补体 216
第一节 概述 216
第二节 补体活性的测定 217
一、血清补体总活性的测定 217
二、补体旁路途径的总补体活性的测定 220
第三节 补体介导的细胞毒实验 221
一、形态学方法检测补体介导的细胞毒活性 221
二、其他方法 222
第四节 补体结合的相关实验 223
一、补体结合实验 223
二、免疫黏附血凝实验 223
第五节 补体成分的测定 225
一、C4的测定 225
二、B因子的测定 227
三、C3的测定 229
四、C1q的测定 230
五、C1INH的测定 230
第六节 补体遗传多态性的检测 231
一、C4遗传多态性的检测 231
二、C2遗传多态性的检测 233
三、B因子遗传多态性的检测 234
参考文献 234
第九章 细胞因子及细胞因子受体 235
第一节 概述 236
第二节 白细胞介素 239
一、白细胞介素及其他细胞因子调节细胞生长的检测 239
二、一些IL的特殊生物学活性的检测 248
三、IL蛋白质的检测 250
四、ILmRNA的检测 250
第三节 肿瘤坏死因子 250
一、检测TNF及细胞因子细胞毒活性的方法 251
二、TNF及其受体家族成员蛋白质的检测 254
三、TNF及其受体家族成员 mRNA的检测 255
第四节 干扰素 255
一、检测IFN和其他细胞因子抗病毒活性的方法 255
二、检测IFN生物学活性的其他方法 260
三、IFN蛋白质的检测 262
四、IFNmRNA的检测 262
第五节 趋化因子 263
一、趋化因子趋化活性的检测 263
二、趋化因子蛋白质的检测 273
三、趋化因子mRNA的检测 273
第六节 集落刺激因子 273
一、SCF诱导MC/9细胞增殖试验 274
二、集落形成试验 275
三、CSF蛋白质的检测 280
四、CSFmRNA的检测 281
第七节 细胞表面和细胞内细胞因子检测技术 281
一、细胞表面细胞因子的分析 282
二、细胞内细胞因子的分析 286
第八节 细胞因子受体研究技术 290
一、膜型细胞因子受体检测方法 291
二、可溶性细胞因子受体检测方法 294
参考文献 294
第十章 人白细胞抗原分型技术 295
第一节 HLA和HLA分型概述 295
一、HLA概念 295
二、HLA抗原分类 295
三、HLA遗传特点 296
四、HLA分型及医学应用 297
第二节 血清学分型技术 297
一、HLAGA、HLAGB、HLAGC抗原的血清学分型方法 298
二、HLAGDR、HLAGDQ抗原的血清学分型方法 299
第三节 细胞学分型技术 300
一、纯合子细胞分型法 301
二、预致敏淋巴细胞定型法 301
第四节 DNA分型技术 302
一、限制性片段长度多态性-聚合酶链反应 302
二、序列特异性寡核苷酸-聚合酶链反应 302
三、序列特异性引物-聚合酶链反应 303
四、单链构象多态性-聚合酶链反应 303
五、PCR指纹图谱 304
六、基因芯片 304
七、展望 305
参考文献 305
第十一章 模式识别受体 307
第一节 模式识别受体的种类 307
第二节 Toll样受体的信号转导 309
一、Toll样受体信号转导的主要途径及常用研究方法 309
二、Toll样受体信号分子功能研究的主要方法 311
参考文献 313
第十二章 免疫荧光技术 314
第一节 概述 314
第二节 免疫荧光技术的基本原理 315
一、抗原 抗体反应 315
二、荧光的产生原理 315
三、荧光效率和影响荧光效率的因素 315
第三节 免疫荧光的基本技术 316
一、抗体的选择 316
二、荧光素的选择 316
三、荧光素的种类 316
四、荧光素标记抗体的方法 319
五、荧光抗体的保存 321
六、免疫荧光技术的染色方法 321
第四节 免疫荧光的分析和检测技术 323
一、荧光偏振免疫分析 324
二、时间分辨荧光免疫分析 324
参考文献 327
第十三章 放射免疫技术 328
第一节 标记抗原的放射免疫技术 328
一、放射免疫技术原理及应用 328
二、实验方法 332
三、放射免疫分析的应用举例 337
第二节 标记抗体的免疫放射技术 338
一、免疫放射技术原理 338
二、免疫放射分析的应用举例 340
第三节 放射受体分析技术 341
一、放射受体分析技术原理 341
二、放射受体分析应用举例 343
第四